抗生素產生殺菌作用主要有4種機制，即：抑制細菌細胞壁的合成、與細胞膜相互作用、干擾蛋白質的合成以及抑制核酸的復制和轉錄。
抑制細胞壁的合成
細菌的細胞壁主要由多糖、蛋白質和類脂類構成，具有維持形態、抵抗滲透壓變化、允許物質通過的重要功能。因此，抑制細胞壁的合成會導致細菌細胞破裂死亡；而哺乳動物的細胞因為沒有細胞壁，所以不受這些藥物的影響。這一作用的達成依賴于細菌細胞壁的一種蛋白，通常稱為青霉素結合蛋白（PBPs），β內酰胺類抗生素能和這種蛋白結合從而抑制細胞壁的合成，所以PBPs也是這類藥物的作用靶點。以這種方式作用的抗菌藥物包括青霉素類和頭孢菌素類，但是頻繁的使用會導致細菌的抗藥性增強。
與細胞膜相互作用
一些抗菌素與細胞的細胞膜相互作用而影響膜的滲透性，使菌體內鹽類離子、蛋白質、核酸和氨基酸等重要物質外漏，這對細胞具有致命的作用。但細菌細胞膜與人體細胞膜基本結構有若干相似之處，因此該類抗生素對人有一定的毒性。以這種方式作用的抗生素有多粘菌素和短桿菌素。
干擾蛋白質的合成
干擾蛋白質的合成意味著細胞存活所必需的酶不能被合成。以這中方式作用的抗生素包括福霉素（放線菌素）類、氨基糖苷類、四環素類和氯霉素。蛋白質的合成是在核糖體上進行的，其核糖體由由50S和30S兩個亞基組成。其中，氨基糖苷類和四環素類抗生素作用于30S亞基，而氯霉素、大環內酯類、林可霉素類等主要作用于50S亞基，抑制蛋白質合成的起始反應、肽鏈延長過程和終止反應。
抑制核酸復制和轉錄
抑制核酸的轉錄和復制，可以抑制細菌核酸的功能，進而阻止細胞分裂和/或所需酶的合成。以這種方式作用的抗生素包括萘啶酸和二氯基吖啶，利福平等。
