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Annexin V PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒

 

 

Annexin V PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒

品牌:Solarbio | 貨號:CA1030|規格:25T/50T/100T|保存:2-8度避光保存,勿冰凍。

 

英文名稱Annexin V PE/7-AAD
別名

細胞凋亡檢測試劑盒

產品簡介:
細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面,這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外,使 PS 暴露在細胞膜外表面。PS 是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內面,在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS 暴露在細胞膜外。Annexin V 具有易于結合到磷脂類如 PS 的特性,對 PS 有高度的親和性。因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的 PS。PS 轉移到細胞膜外不是凋亡所*的,也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此,可以采用 AnnexinV 與7-AAD 雙染的方法,通過流式檢測細胞早期凋亡。

 

操作步驟:

1、細胞樣品的準備: a)對于貼壁細胞:小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用不含 EDTA 的胰酶消化細胞,細胞可以被輕輕 用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細胞培養液,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次 收集到離心管內。1000rpm 左右離心 5min,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞無法*離心離心管底, 可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50µl 左右的培養液,以避免吸走細胞。加入約 1ml 4℃預冷的 PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清; b)對于懸浮細胞:1000rpm 左右離心 5min,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞無法*離心離心 管底,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50µl 左右的培養液,以避免 吸走細胞。加入約 1ml 4℃ 預冷的 PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清;

2、用去離子水按 1:3 稀釋結合緩沖液(4ml 4x 結合緩沖液+12ml 去離子水);

3、用 1x 結合緩沖液重新懸浮細胞,調節其濃度為 1-5×106 /ml;

4、取 100µl 的細胞懸液于 5ml 流式管中,加入 5µlAnnexin V/PE 混勻后于室溫避光孵育 5 分鐘;

5、加入 10µl 20ug/ml 的 7AAD,并加 400µl PBS,立刻進行流式檢測。

 

實驗設計:

1)未轉染細胞 空白管:陰性對照組細胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于調節電壓; 單染管:陽性對照組細胞,只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于調節補償; 檢測管:處理的細胞,加 Annexin V/PE,7AAD。用空白管和單染管調節好電壓補償后,獲得所需要的流式數據。

2)轉染 GFP 未轉染空白管:未轉染細胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于調節電壓; 未轉染單染管:未轉染且有明顯凋亡的細胞,只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于調節補償; 轉染 GFP 空白管:轉染 GFP 對照組細胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于調節補償 檢測管:處理的細胞,加 Annexin V/PE,7AAD。調節好電壓補償后,獲得所需要的流式數據。

 

注意事項:

1、Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和,而 PS 在不同種屬間沒差異。在正常細胞中,PS 只分布在細胞膜脂 質雙層的內側,而在細胞凋亡早期,PS 由脂膜內側翻向外側;

2、低濃度胰酶消化,輕柔吹打貼壁細胞 2~3 次,離心機 4℃1000rpm 5min 離心,處理得當的話,胰酶造成損 傷可以控制在 5%以內,有對照組的情況下對實驗結果不會造成明顯影響。

3、先加PI 不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷,而且 PI 本身對細胞也是有毒性的,對實驗結果影響會比胰 酶大,不建議這樣做;

4、Annexin V 是Ca 依賴的蛋白,所以不能加入 EDTA,防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V,進而影 響結果。

5、用流式檢測凋亡時,PI 受時間的影響很大,因標記了 PI 后會加大細胞毒性,隨著時間延長會導致 PI 的染 色增加,特別是檢測早期凋亡時,如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外,誤差會明顯 加大。一般 PI 加上后立刻上機,然后在一個小時內檢測完成。兩種方法都可以,但是按照我們操作步驟造成 的誤差會更小。

 

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