文獻背景
由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的冠狀病毒病 于2019年12月爆發，導致健康危機。SARS-CoV-2變異體的快速傳播表明，目前批準的抗SARS-CoV-2藥物、中和抗體和疫苗的有效性存在局限性。盡管為藥物再利用做出了相當大的努力，但治療和遏制SARS-CoV-2感染仍然需要有效抗病毒活性的新型化合物。SARS-CoV-2的感染需要將SARS-CoV-2的S蛋白的受體結合域（RBD）與宿主的細胞血管緊張素轉化酶2（ACE2）的受體結合。抗SARS-CoV-2中和單克隆抗體（mAbs）被設計用于與S蛋白的RBD或RBD-ACE2結合位點的表位發生靶向相互作用，或被選擇具有強大的中和活性，但是其需要對病人每kg體重用量為4-100毫克才能達到有效治療，儲存和運輸條件都較為復雜，且抵抗SARS-CoV-2變體幾乎無效，特別是針對奧密克戎。因此，需要尋找一種特異性相對較低且具有更廣譜治療能力的替代方法。
納米材料（NMs）的抗菌和抗病毒能力引起了作者的極大興趣。金屬NMs通過金屬原子與病毒組分的相互作用顯示出了抗病毒能力，例如金NMs具有可調的表面化學設計，其模擬病毒粘附的硫酸類乙酰肝素已成功應用于抑制各種病毒的感染。由于RBD的β構型和正表面電荷，RBD會優先吸附在帶有大量負電荷的二維（2D）NM表面，于是作者篩選了一系列帶負電荷的NMs進行抗病毒活性研究。最后確定為超薄二維銅銦磷硫（CuInP2S6，CIPS）納米材料（NSs），其具有強大的抗SARS-CoV-2能力。
基本信息
摘要
嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）大流行造成緊急情況，只有通過有效和廣泛的預防和治療策略以應對，而目前兩者仍然存在不足。作者研究了一種超薄二維銅銦磷硫（CuInP2S6，CIPS）納米材料作為抗SARS-CoV-2感染的新藥物。針對野生型SARS-CoV-2及其變體（德爾塔和奧密克戎）內部的刺突蛋白受體結合域，CIPS展現出一個高的選擇性結合能力（解離常數（KD）< 1 pM），其能抑制病毒進入和感染攜帶血管緊張素轉換酶2（ACE2）的細胞、人呼吸道上皮器官和ACE2轉基因小鼠。在與CIPS結合后，SARS-CoV-2病毒被巨噬細胞快速吞噬和清除，這表明CIPS可以成功地用于捕獲和促進宿主清除病毒。因此，作者建議CIPS作為一種納米藥物，用于未來安全有效的抗SARS-CoV-2治療，并作為一種凈化劑和表面涂層材料來降低SARS-CoV-2的傳染性。
研究內容及結果
1. CIPS在體內外抑制SARS-CoV-2感染
通過掃描電鏡和透射電鏡測定，片狀剝落的CIPS具有多層結構，平均尺寸為～200nm（圖1a），通過原子力顯微鏡測定，平均厚度為～3.1nm圖（1b，c）。根據擴展X射線吸收精細結構（EXAFS）分析，銅原子與硫原子配位（圖1d），大部分Cu原子為+1價。硫以硫化物（S2-）的形式存在。銦原子的化學形式與CIPS的晶體結構相一致，位于兩個不同的CIPS表面之間，通過與磷和硫原子配位，穩定地支持CIPS的結構（圖1e），銅、硫和磷原子主要定域在其表面，銦原子浸沒于其中。
作者評估了CIPS對真實SARS-CoV-2病毒的抗病毒作用。在CIPS存在的情況下，SARS-CoV-2感染Vero-E6細胞48小時后，SARS-CoV-2感染率以CIPS劑量依賴性的方式下降（圖1f，g），而細胞活力不受影響，選擇性指數（SI，細胞毒性和抗病毒，藥物濃度之間的比率）超過17.6（圖1g）。相位對比影像（圖1h）顯示，CIPS抑制了病毒誘導的細胞病變。用CIPS處理被SARS-CoV-2感染的Vero-E6細胞時，CIPS的抗病毒作用也很明顯（圖1i，j）：病毒感染24小時后加入CIPS仍能有效抑制體外SARS-CoV-2，病毒感染4小時后CIPS抑制作用最大。
圖1
CIPS的抗SARS-CoV-2效果采用了氣/液界面培養的人呼吸道上皮類器官模型（圖1k-n）進行了評估。類器官呈現出多層氣道上皮結構，朝向空氣的一面是纖毛細胞，模仿人類呼吸道上皮的結構。CIPS處理后，引起SARS-CoV-2復制減少40%（圖1k），同時有效保護了被SARS-CoV-2感染后嚴重破壞的組織完整性（圖1l，m）。SARS-CoV-2感染還引起上皮細胞厚度的增加，這是一個持續感染的跡象，而CIPS治療減少了這種情況（圖1n）。
作者評估了CIPS在人ACE2（hACE2）轉基因小鼠體內的抗SARS-CoV-2能力。小鼠鼻內感染SARS-CoV-2前后用CIPS（每kg體重4-8mg）進行治療（圖2a，b），并在感染后3天評估肺中SARS-CoV-2的存在情況。2種劑量的CIPS治療均顯著降低了感染率（圖2a），CIPS在治療和預防方面均非常有效（圖2b)。組織損傷和白細胞浸潤（圖2c）、肺部炎癥因子的表達降低（圖2d），這些均證實了感染率的減少。
相關實驗也證明，CIPS對SARS-CoV-2的所有變體均具有很高的結合能力，CIPS可以有效抑制SARS-CoV-2變體的病毒感染。
圖2
2. CIPS對SARS-CoV-2的抑制機制
在排除了可能的金屬離子影響后（補充圖7），作者通過TEM（補充圖8a）、CIPS的理化性質的變化（補充圖8b,c）和Western blotting（補充圖8d）證實了CIPS與SC2-P的相互作用。CIPS能有效地吸附和捕獲SARS-CoV-2病毒（圖3a、b）以及分離S蛋白。CIPS與S蛋白RBD具有非常高的親和力（解離常數（KD）<0.001nM，圖3c），而對其他血清蛋白和因子的親和力至少低100倍（圖3d）。在復雜的環境中（過量的小鼠肺勻漿或胎牛血清），CIPS對SC2-P的S蛋白保留了很強的結合能力和完整的抗病毒能力（圖3e，補充圖8h）其他二維納米材料（MoS2和氧化石墨烯（GO））顯示出明顯較低的RBD結合能力（KD=11.7和5.2nM，補充圖9）。它們的KD（CIPS?GO＜MoS2）與它們的抗病毒活性相關。擴展數據圖1b）。在RBD與ACE2的結合方面 (KD=11-17.4nM)，與報道的數據一致，如果RBD預先暴露于CIPS，即使在很低的測試濃度（15 fM；圖1）下，RBD與ACE2的結合也*被消除。測試濃度（15 fM；圖3f）。與商業化的mAb相比，CIPS的抑制能力顯著較高（圖3f 和補充圖10），通過計算抑制常數(Ki），CIPS為0.053 fM，而mAb為75pM。
通過分子動力學（MD）模擬研究了RBD在CIPS表面的吸附作用，利用ACE2和S蛋白的晶體結構闡明了它們的結合界面，而與ACE2結合的RBD的氨基酸殘基被列在擴展數據中。用圓二色技術（CD）對存在或不存在CIPS時RBD的二級結構進行表征，表明大部分RBD結構以β-折疊構象存在（圖3g）。由于β-折疊構象促進了非結構蛋白吸附，這可能解釋了RBD與CIPS的優先結合。與CIPS結合后，RBD的構象也發生了變化（圖3g），α-螺旋和旋轉構象數量減少，β折疊構象和隨機線圈增加。
圖3
3.CIPS促進巨噬細胞清除SARS-CoV-2
作者研究了病毒在與CIPS結合時是否能更好地吞噬和清除病毒。CIPS相關的SC2-P可以在培養24小時后被人巨噬細胞有效吞噬，并且病毒在隨后的降解過程中被有效清除（圖5a，b）。經巴菲洛霉素（BM）溶酶體抑制后，SC2-P在巨噬細胞中積累（圖BM；圖5a，b），并與溶酶體共定位（圖5c)，這表明大部分SC2-P在吞噬溶酶體中被降解。同樣，用真實的SARS-CoV-2病毒進行的實驗表明，與CIPS結合的SARS-CoV-2病毒可以被巨噬細胞有效地吸收和清除（圖5d，e），而BM抑制溶酶體顯著增加了SARS-CoV-2的細胞內水平，說明SARS-CoV-2的清除是溶酶體依賴性的（圖5e）。
作者研究了巨噬細胞對病毒的攝取是否只導致病毒的降解，是否也能導致細胞的感染。在使用SC2-P和真實的SARS-CoV-2病毒時，作者觀察到CIPS對病毒的攝取是依賴溶酶體的，對CIPS相關病毒的攝取并沒有引起巨噬細胞的感染，因為在培養中無法觀察到病毒的釋放。(圖5f,g）。這表明，巨噬細胞可以有效地攝取并清除與CIPS相關的SARS-CoV-2。巨噬細胞在CIPS促進的病毒清除的作用，在hACE2轉基因小鼠的體內數據得到進一步證明。CIPS在抑制SARS-CoV-2復制的同時，增強了SARS-CoV-2和巨噬細胞在肺部的共定位（圖5h）。
使用透射X射線顯微成像結合納米計算機斷層掃描（Nano-CT）觀察細胞內CIPS，顯示在暴露12小時后，細胞內CIPS大量積累，在無CIPS培養基中48小時后，細胞內CIPS顯著下降（圖5i）。根據電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析銦含量的結果顯示，巨噬細胞對CIPS的吸收是呈時間依賴性的，從培養基中去除CIPS后，銦含量隨時間的推移而降低（圖5j）。同時成像定量結果表明，CIPS被巨噬細胞降解。用Cu XANES譜分析來定量CIPS在巨噬細胞中積累和降解的化學變化。結果表明，Cu在內化CIPS中的形式為+1價態，Cu以Cu-S的化學形式存在。隨著時間的推移，Cu在巨噬細胞中從+1價變為+2價，銅的化學形式從Cu-S到Cu-O/Cu-OOC（圖5k，l），這表明在細胞內轉運過程中，CIPS從氧化到降解，很可能在酸性吞噬溶酶體中發生。繼續監測CIPS的生物分布和降解，顯示在肺內6h積累最多，在7天后被*清除（圖5m，n），說明CIPS與巨噬細胞有明確關聯（圖5o）。
對巨噬細胞中CIPS依賴的病毒清除進行詳細的化學分析表明，在溶酶體樣酸性環境下銅離子（Cu+和Cu2+）促進過氧化氫生成羥基自由基。羥基自由基的強氧化能力可能會破壞病毒的結構和蛋白質、脂質、核酸等成分（補充圖17a，e）。
為了研究針對SARS-CoV-2的CIPS的吞噬作用是否能促進保護性免疫，作者檢測了CIPS上調巨噬細胞活化和抗原呈遞相關分子表達的能力。與單獨暴露于病毒中的細胞作比較，CIPS上調了SARS-CoV-2處理的巨噬細胞中CD86和HLA-DRA的表達，這是抗原呈遞的兩個重要分子（圖5p）。這些結果表明，CIPS結合的SARS-CoV-2可以促進巨噬細胞中MHC II分子中的抗原呈遞，從而可能觸發適應性抗病毒免疫應答。
圖5
補充圖17
結論
2D CIPS NS作為一種有效的納米膠，通過結合病毒SARS-CoV-2的S蛋白選擇性捕獲這種病毒，從而抑制宿主細胞的感染。CIPS與SARS-CoV-2的S蛋白RBD的結合親和力小于1pM，形成了非常穩定的復合物，并且有效結合了SARS-CoV-2 RBD中8個可結合ACE2的氨基酸殘基，從而有效地抑制了病毒的感染性。此外，SARS-CoV-2 VOCs所顯示的RBD突變并不影響其與CIPS的結合，表明CIPS在抑制病毒變體感染性方面具有廣譜性，其在體外和體內的預防和治療策略中都有明顯的效果。綜上所述，CIPS是一種安全有效、具有良好生物相容性和生物可降解性的2D 納米材料，能夠抑制SARS-CoV-2的感染并促進清除（圖6）。
圖6
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