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文獻解讀|妊娠引起的腸道菌群改變驅動巨噬細胞焦亡和膿毒癥炎癥反應

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文獻背景


膿毒癥是一種多因素疾病,常繼發于感染,可導致多器官功能障礙。妊娠引起的生理變化使個體容易出現膿毒癥,并帶來更高的死亡風險。然而,造成死亡率增加的機制尚不清楚,針對懷孕膿毒癥患者缺乏適當的治療方法。因此,確定膿毒癥患者全身免疫紊亂的機制是揭示改善產婦和新生兒健康的潛在治療方法。腸道菌群由數萬億細菌組成,能調節感染引起的多器官衰竭的易感性。腸道菌群調節疾病病理的主要機制包括:(1)腸道上皮屏障破壞引起的腸漏的發生,(2)腸道內細菌代謝產物或外膜囊泡的分泌,(3)腸道菌群代謝物耗竭還原型谷胱甘肽,從而介導對乙酰氨基酚誘導的肝毒性的晝夜變化。此外,腸道細菌來源的格拉司瓊通過重新編程巨噬細胞因子反應來保護膿毒癥誘導的肝損傷。懷孕改變了腸道微生物菌群的組成,使宿主容易出現代謝綜合征。因此,作者假設產婦膿毒癥的高死亡率與腸道微生物菌群失調有關。

異質核糖核蛋白U-like protein 2(hnRNPUL2)作為一種RNA結合蛋白可以穩定長非編碼RNA結直腸腫瘤的差異表達(CRNDE),并激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,以促進結腸癌的發生。本研究中,作者想要研究腸道微生物菌群失調在膿毒桿菌宿主免疫功能障礙中的作用。利用細菌中的同源重組,作者證明在懷孕期間微生物釋放刺芒柄花素(FMN)減少。妊娠引起的腸道菌群紊亂增加了膿毒癥的易感性,這是由于細胞核中hnRNPUL2的積累導致巨噬細胞凋亡,這為限制膿毒癥嚴重程度的潛在療法提供了線索。



基本信息


題目:

Pregnancy-induced changes to the gut microbiota drive macrophage pyroptosis and exacerbate septic inflammation

期刊:

Immunity

影響因子:32.4

PMID:

36792573 

通訊作者:

龔神海 姜勇 肖煒

作者單位:

南方醫科大學

索萊寶合作產品:

產品貨號

產品名稱

BC2580

β-半乳糖苷酶(β-GAL)

活性檢測試劑盒

G8860

β-半乳糖苷酶



摘要


膿毒癥系指宿主對病原體感染的免疫反應失調引起危及生命的全身炎癥反應綜合征,是妊娠期女性患者入院產科ICU的主要病因,常常導致新生兒發育畸形、早產以及流產等嚴重后果,也是全球孕產婦死亡的主要原因。

研究人員利用多組學測序和同源重組技術對妊娠期女性和小鼠腸道細菌研究發現,糞副擬桿菌(Pmerdae)及其衍生代謝物刺芒柄花素(FMN)的含量降低,由此導致妊娠期宿主的巨噬細胞大量死亡、機體免疫力下降,從而增加了妊娠期宿主對膿毒癥的易感性。FMN屬于常見的中藥單體,具有益氣養陰的功效。本研究發現FMN能夠抑制膿毒癥宿主的大量腹腔巨噬細胞發生焦亡,增加腹腔巨噬細胞數量以殺滅入侵的病原體,從而降低膿毒癥的死亡率。

此外,該團隊通過蛋白質組學和表面等離子體共振技術成功鑒定巨噬細胞內異質核糖核蛋白UL2(hnRNPUL2)作為FMN的負向調控蛋白受體,在膿毒癥期間由胞內移位至胞核并結合Nlrp3基因啟動子區域,啟動焦亡相關基因表達,引起巨噬細胞焦亡,而敲低hnRNPUL2表達,能夠防止膿毒癥小鼠的多器官功能衰竭并降低死亡率。臨床研究也發現,膿毒癥患者糞便P.merdae和FMN含量與患者疾病進展呈現出負相關。

該研究揭示了孕產婦體內“P.merdae-FMN-hnRNPUL2"的微生物免疫軸在膿毒癥期間的重要生物學意義,為開發妊娠期膿毒癥所致的免疫紊亂的精準治療方案提供了新的策略。



研究內容及結果



1.妊娠加重了膿毒癥


比較妊娠小鼠(P)和未妊娠小鼠(NP)在盲腸結扎和穿刺(CLP)后36小時的總死亡率。與NP組相比,P組CLP后死亡率顯著升高(圖1A)。同樣的結果也出現在脂多糖刺激小鼠組,CLP后,P組小鼠的血漿丙氨酸轉氨酶(ALT)、肌酐(Cr)濃度以及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的總蛋白含量高于NP小鼠(圖1B)。組織病理學檢查顯示,與NP小鼠相比,P小鼠出現了更嚴重的多器官損傷(圖1C和1D)和細胞死亡(圖1E和1F)。作者量化了P組CLP小鼠血漿和腹腔灌洗液(PLF)中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度,發現大多數細胞因子在P組CLP小鼠中升高(圖1G和1H)。通過qRT-PCR比較PLF和BALF細胞的細胞因子和趨化因子,發現CLP后P小鼠的TNF-α、IL-1β、Il-6、Ccl2、Ccl3和Cxcl2 mRNA轉錄量高于NP小鼠。妊娠增強了CLP誘導的不同組織的局部炎癥反應,從而增加了細胞因子和趨化因子的mRNA(圖S1C)。雖然P和NP小鼠的糞便總菌量沒有統計學差異(圖S1D),但P組CLP小鼠的血液和PLF中的活細菌增加(圖1I)。16S分析結果與P組CLP小鼠血液和PLF的細菌培養結果一致(圖S1E)。P小鼠對銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)引起的肺炎也表現出更強的易感性,表現為生存期縮短,肺損傷加重,以及強烈的局部和全身炎癥(圖1J和S1F-S1J)。妊娠通過加重炎癥反應和抑制病原體清除能力,增加了膿毒癥誘導的多器官衰竭的易感性。

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圖1


2.膿毒癥死亡率的增加與腸道菌群有關


作者為了排除腸道感染源的改變可能直接導致妊娠期CLP誘導的膿毒癥易感性增加的可能性,從NP和P小鼠中分離了盲腸細菌。分別腹腔注射來自NP和P小鼠的盲腸細菌混合物(CBMs)誘導的兩組膿毒癥小鼠均表現出相似的易感性(圖2A,S2A和S2B)。通過給廣譜抗生素(ABX)預處理3天耗盡腸道微生物群,然后對小鼠進行CLP或LPS處理,給藥ABX的腸道菌群缺失在NP和P小鼠間沒有引發任何病理變化(圖2C),在生存曲線統計學上無明顯差異(圖2B和2C)。作者對懷孕個體進行了糞便菌群移植(FMT)。接受NP供者糞便的NP小鼠比接受P供者糞便的NP小鼠對膿毒癥的抵抗力更強(圖2D-2F)。此外,接受P供體糞便的NP小鼠在膿毒癥期間具有更高的血清ALT活性和BALF總蛋白含量(圖2G)。在膿毒癥反應中,接受懷孕供者糞便的NP小鼠比接受NP供者糞便的NP小鼠發生更嚴重的器官損傷。此外,在CLP后6小時,接受P供者糞便的NP小鼠的血漿細胞因子濃度高于接受NP供者糞便的NP小鼠(圖2H)。P組糞便微生物群的移植也加速了銅綠假單胞菌感染引起的膿毒癥小鼠的死亡。相反,與接受P個體糞便的P小鼠相比,NP個體的糞便移植降低了膿毒癥的高死亡率。總的來說,懷孕期間微生物組的變化足以導致膿毒癥的增加。

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圖2


3.妊娠期間糞副擬桿菌和FMN豐度降低


16S rRNA基因測序顯示,腸道微生物群存在明顯的組間分離(圖3A和3B)。此外,懷孕引起了腸道微生物群組成的變化。線性判別分析(LDA)表明,懷孕女性和小鼠共性只有糞副擬桿菌呈下降趨勢(圖3C和3D)。主成分分析(PCA)顯示P小鼠腸道菌群代謝譜發生了顯著變化(圖3E)?;鹕綀D和熱圖分析顯示,強效抗炎劑FMN在P小鼠中的水平較低(圖3F和S4E),靶向液相色譜—串聯質譜分析進一步證實了這一點(圖3G)。與NP組相比,P組女性的FMN較少(圖3H)。


4.來自糞副擬桿菌的β-D-半乳糖苷酶是腸道中FMN的關鍵貢獻者


用ABX處理的小鼠中觀察到FMN濃度降低,這表明FMN的產生依賴于腸道微生物群(圖S4F)。通過綜合多組學分析,證實了樣本中糞副擬桿菌豐度與FMN豐度之間的相關性(圖3I)。此外,P組糞副擬桿菌的豐度在懷孕的人和小鼠中都有所下降,而其他物種的豐度沒有下降(圖3J,3K,S4G和S4H)。在CLP小鼠的PLF中,糞副擬桿菌豐度降低。為了進一步闡明FMN的產生機制,將P組糞副擬桿菌進行了全基因組測序,發現該菌株的基因組包含13個ORF編碼不同β-半乳糖苷酶家族成員(圖S4K)。β-D-半乳糖苷酶能以鈣依賴的方式促進小鼠FMN的釋放(圖3L)。NP和P小鼠的食物攝取量相似,FMN的差異主要來自于腸道中糞副擬桿菌數量。在糞副擬桿菌的基因組中存在4個編碼β-D-半乳糖苷酶成員;然而,只有ORF01166具有典型的N端信號肽,用于分泌在Ser26處有切割位點(圖3M、3N和S4N)。利用同源重組技術制備了P組糞副擬桿菌菌株ORF01166缺陷突變體(圖S4O)。缺失該基因可阻斷β-半乳糖苷酶的分泌和FMN的產生(圖3O-3Q)。野生型糞副擬桿菌預處理的膿毒癥小鼠的FMN濃度升高,而β-D-半乳糖苷酶缺陷突變株的FMN濃度沒有升高(圖4A)。隨著糞副擬桿菌減少,妊娠導致膿毒癥小鼠PLF中FMN濃度降低,表明P組糞副擬桿菌通過妊娠期間FMN的減少參與膿毒癥的進展。

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圖3


5.糞副擬桿菌或FMN治療可減輕P和NP小鼠的膿毒癥的相關炎癥


ELISA檢測發現經糞副擬桿菌灌胃預處理的NP組CLP小鼠血漿和PLF中TNF-α、IL-1β和IL-6均降低(圖4B和S5A)。同樣,糞副擬桿菌預處理分別提高了NP內毒素小鼠和P組CLP小鼠的存活率(圖4C和S5B)。FMN單獨處理不會對NP小鼠產生毒性。FMN抑制了血漿ALT、天冬氨酸轉氨酶(AST)、Cr濃度和髓過氧化物酶(MPO)活性,并提高了CLP小鼠的存活率(圖4D和4E)。FMN減少了CLP小鼠肝、腎和肺的病變和細胞死亡(圖4F-4I)。FMN降低了CLP小鼠肺中CD11b+細胞的浸潤,這與血清中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度的降低一致。FMN降低了CLP小鼠PLF和血液中的細菌數量(圖4J)。與FMN處理小鼠相比,對照組小鼠在LPS處理后出現更嚴重的膿毒癥。糞副擬桿菌中β-D-半乳糖苷酶基因缺失破壞了其對CLP小鼠MOF的預防作用(圖4K)。綜上所述,數據表明糞副擬桿菌或FMN對膿毒癥小鼠具有保護作用。

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圖4


6.腸道菌群失調與妊娠期膿毒癥免疫功能障礙有關


經CLP或LPS處理的P小鼠PLF中巨噬細胞和中性粒細胞數量減少(圖5A和S6A)。經ABX預處理后,P型和NP型膿毒癥小鼠PLF中巨噬細胞和中性粒細胞數量相似(圖5B和S6B)。此外,與接受NP供者糞便的小鼠相比,預先給予P供者糞便的膿毒癥小鼠PLF中的巨噬細胞和中性粒細胞數量減少(圖5C,S6C和S6D)。此外,小鼠氣管內感染銅綠假單胞菌的血液中單核細胞和中性粒細胞的減少取決于妊娠期間腸道微生物群的失調,腸道菌群失調會促進膿毒桿菌小鼠的免疫功能障礙。


7.FMN可消除膿毒癥小鼠巨噬細胞的減少


巨噬細胞的耗竭不僅加速了膿毒癥小鼠的死亡,而且降低了FMN誘導的對膿毒癥的保護作用(圖5D)。無論給藥與否,巨噬細胞耗竭都加劇了膿毒癥小鼠的多器官衰竭指數(圖5F和S6N)。無論給藥與否巨噬細胞耗竭損害了細菌清除,導致CLP小鼠血液中細菌負荷和PLF升高(圖5H)。正如研究者所預期的,糞副擬桿菌和FMN均能增加膿毒癥小鼠腹膜巨噬細胞的數量(圖5I和5J)。FMN能夠通過抑制免疫功能障礙來促進細菌清除,從而降低膿毒癥小鼠的死亡率。

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圖5


8.FMN抑制膿毒癥中巨噬細胞焦亡


妊娠增加了CLP小鼠腹腔巨噬細胞的細胞死亡(圖6C),在接受P糞便的膿毒癥小鼠中觀察到類似的結果(圖6D)。FMN可降低CLP小鼠PLF中巨噬細胞死亡(圖6E)。用抑制劑VX765治療的膿毒癥小鼠腹腔巨噬細胞數量增加(圖6F),而用其他細胞死亡抑制劑治療的小鼠腹腔巨噬細胞數量沒有增加(圖S6P)。轉錄組分析顯示,FMN改變了LPS + ATP處理的BMDMs的基因表達譜和NOD樣受體信號通路(圖S6Q和S6R)。FMN給藥后,BMDMs中含有由LPS和ATP誘導的CARD (ASC)寡聚的凋亡相關斑點狀蛋白被抑制(圖6K和6L)。VX765極大地抑制了BMDMs的凋亡,而FMN沒有表現出額外的抑制作用(圖S6T和S6U)。FMN除巨噬細胞增加外,巨噬細胞的吞噬能力也明顯增強(圖S6V和S6W)。

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圖6


9.核hnRNPUL2通過結合Nlrp3啟動子誘導巨噬細胞凋亡


蛋白質組學分析顯示,RNA結合蛋白hnRNPUL2是在LPS + ATP處理的BMDMs中FMN給藥后減少最多的蛋白(圖7A)。使用RNA干擾技術穩定地降低了hnRNPUL2在BMDMs中的表達(圖S7B)。hnRNPUL2的基因沉默導致ASC寡聚化的抑制和細胞死亡的減少(圖S7C-S7F)。免疫沉淀分析顯示FMN在體外直接與hnRNPUL2相互作用(圖S7H)。熒光染色顯示,FMN增強了hnRNPUL2和溶酶體在LPS + ATP處理的BMDMs中的共定位。hnRNPUL2直接與BMDMs中Nlrp3的啟動子區結合(圖S7K)。FMN顯著降低了LPS + ATP處理Raw264.7細胞中Nlrp3啟動子的轉錄活性(圖S7L)。


10.糞副擬桿菌的菌群失調通過FMN-hnRNPUL2-NLRP3軸增強了膿毒癥的易感性


腺相關病毒沉默了小鼠hnRNPUL2(AAV)介導的傳遞技術(圖S7M)。hnRNPUL2的遺傳沉默改善了CLP小鼠的存活率和減毒MOF(圖7M、7N和S7N)。糞副擬桿菌的豐度與膿毒癥患者血漿降鈣素原(PCT)和Cr濃度呈負相關(圖7O)。同時,膿毒癥患者腸道FMN含量與血清ALT和AST濃度呈負相關(圖7P)。綜上所述,揭示了糞副擬桿菌的菌群失調在介導免疫軸FMN-hnRNPUL2-NLRP3中的意義,該軸通過誘導膿毒癥患者巨噬細胞焦亡進而引起免疫功能障礙。

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圖7



結論


本實驗中,研究人員使用抗生素治療和糞便微生物轉移,發現在小鼠和人類中,膿毒癥易感性是由妊娠引起的菌群變化驅動的。綜合多組學和細菌基因工程學研究表明,妊娠期腸道糞副擬桿菌(P. merdae)的數量降低導致了FMN的降低和巨噬細胞死亡的增加。從機制上講,FMN通過抑制hnRNPUL2的積累以及與NLRP3啟動子的結合來抑制巨噬細胞焦亡。用FMN治療或敲除小鼠hnRNPUL2可防止感染性炎癥。P. merdae和FMN的腸道含量與膿毒癥患者的進展呈負相關??傊沂玖嗽谌焉锬摱景Y宿主中被破壞的微生物免疫途徑,突出了FMN-hnRNPUL2-NLRP3在膿毒癥治療方面的潛力。


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