文獻背景
蚜蟲是具破壞性的農業和園藝害蟲,以韌皮部為食,超過40%的植物病毒依靠蚜蟲傳播來感染植物,因此對作物生產造成了大規模的破壞。蚜蟲侵害會誘導植物釋放包含水楊酸甲酯(MeSA)、水楊酸結合蛋白-2(SABP2)、轉錄因子NAC2和水楊酸-羧甲基轉移酶-1(SAMT1)在內的VOCs。MeSA在植物防御蚜蟲等草食性昆蟲侵害中發揮重要作用,包括驅除昆蟲、吸引捕食者或降低昆蟲的生存適應性等方式。MeSA被認為是植物內部和長距離移動信號,參與誘導對微生物病原體和食草昆蟲的系統獲得性抗性(SAR)。在SAR過程中,水楊酸(SA)在病原體感染的細胞中積累,并通過SAMT1轉化為MeSA;然后,MeSA通過韌皮部進入遠端組織,隨后在未侵染葉中被SABP2重新轉化為SA。雖然已知MeSA作為植物內SAR信號的功能,但MeSA如何作為植物間通訊的信號激活AD抗蚜蟲防御是一個長期未解決的問題。植物是否擁有識別和感知空氣中MeSA的受體也不清楚。此外,蚜蟲和病毒能否干擾植物氣傳性免疫也未知。本研究揭示了AD的分子機制和蚜蟲-病毒共同進化的共生關系,證明AD是控制蚜蟲和病毒的潛在仿生策略。
基本信息
Molecular basis of methyl-salicylatemediated plant airborne defence
期刊:
Nature
影響因子:64.8
通訊作者:
劉玉樂
作者單位:
清華大學等
索萊寶合作產品:
產品貨號 | 產品名稱 |
IB0100 | 6-芐氨基喋呤(6-BA) |
IA1310 | 腺苷-5'-三磷酸 |
N8010 | α-萘乙酸(NAA) |
摘要
蚜蟲是具破壞性的作物害蟲之一,被蚜蟲侵害的植物會釋放揮發性化合物,以引起鄰近植物的氣傳性免疫(AD)。本文揭示了MeSA、SABP2、轉錄因子NAC2和SAMT1形成了信號通路來介導鄰近植物針對蚜蟲和病毒的AD??諝庵蠱eSA能夠被MeSA受體蛋白水楊酸結合蛋白-2(SA-binding protein-2,SABP2)感知并轉化為水楊酸(salicylic acid, SA)。水楊酸引起信號轉導級聯反應,SA激活轉錄因子NAC2,上調水楊酸羧基甲基轉移酶1(SA-carboxylmethyltransferase-1,SAMT1)基因的表達,激活NAC2-SAMT1模塊從而產生更多的MeSA,誘導植物的抗蚜蟲免疫,從而降低病毒的傳播。一些蚜蟲傳播病毒比如黃瓜花葉病毒、馬鈴薯Y病毒等能夠編碼含有解旋酶結構域的蛋白質,通過與NAC2蛋白相互作用來抑制AD,改變NAC2蛋白的亞細胞定位,促進NAC2在細胞質中被26S蛋白酶體降解,從而負調控NAC2-SAMT1通路,抑制MeSA的合成和揮發,阻斷植物間“預警"通訊,促進蚜蟲對鄰近植物的侵染和對病毒的傳播。本研究揭示了AD的分子機制和蚜蟲-病毒共同進化的共生關系,表明AD是一種潛在的生物仿生策略,可以控制蚜蟲和病毒的傳播。
研究內容及結果
作者通過免疫沉淀-質譜分析策略(IP-MS),成功鑒定了本氏豬籠草中黃瓜花葉病毒(CMV)的病毒發病機制過程中,核心蛋白CMV1a的相互作用蛋白組,并確定NAC2為CMV1a的重要相互作用因子,以進行后續實驗(擴展數據圖1a)。CMV1a-NAC2相互作用通過免疫共沉淀(co-IP)、雙分子熒光(BiFC)和熒光素酶互補成像(LCI)試驗進一步驗證(擴展數據圖1b-d)。為了評估NAC2是否影響CMV對NAC2.1/NAC2.2雙敲除(KO)突變株的感染,通過比較CRISPR-cas9基因編輯(擴展數據圖2a)產生的突變株(NAC2植株)和野生型(WT株)的感染結果,發現CMV感染導致NAC2突變株的癥狀更嚴重,病毒RNA和外殼蛋白(CP)的量更高(擴展數據圖1e-g)。用GFP標記的馬鈴薯病毒Y或GFP標記的TMV(TMV-GFP)感染的突變株和野生型植株中也有類似的結果(擴展數據圖1h-m)。這些數據表明,NAC2對植物抗病毒防御至關重要。
擴展數據圖1
2. 證明NAC2通過MeSA介導AD對抗蚜蟲
作者在研究中注意到,在NAC2葉子上定植的綠桃蚜蟲數量比在WT葉子上的數量多得多,進一步研究了NAC2植株對蚜蟲吸引力的作用。作者進行了圓形培養皿和Y管嗅覺儀生物測定,發現NAC2植株比WT植株吸引了更多的蚜蟲,推測這可能是由空氣傳播信號介導的(擴展數據圖1n-o)。作者使用氣相色譜法與MS(GC-MS)相結合來鑒定蚜蟲侵襲的WT植株與NAC2植株釋放的揮發物。而MeSA是蚜蟲侵襲WT植株與NAC2植株產生差異的VOC,并且蚜蟲侵染后WT釋放的MeSA多于NAC2植株(擴展數據圖2e-h)。MeSA是有據可查的可誘發蚜蟲的VOC10-13主要揮發物。為了測試NAC2植株對蚜蟲吸引力的影響是否歸因于MeSA的揮發,研究人員使用GC-MS測量了對蚜蟲侵襲的WT植株在空氣中MeSA的排放率,發現每個蚜蟲侵襲的WT植株MeSA的排放率為34ng h?1(相當于每天排放0.816µg)(擴展數據圖2f)。此外,研究人員發現,含有0.8µg MeSA/羊毛脂處理的植株與蚜蟲侵襲的WT植株有相似的MeSA排放(擴展數據圖2i,j)。因此,研究人員使用0.8µg MeSA/羊毛脂涂抹對植株進行處理,結果表明NAC2和WT植株對蚜蟲表現出相似的吸引力(擴展數據圖1p,q)。然而,當單獨用羊毛脂或羊毛脂與其他揮發物(如3,3-二甲基己烷)處理時,NAC2植株比WT植株對蚜蟲更具吸引力(擴展數據圖1r,s)。研究人員將NAC2和WT植株置于揮發性MeSA下24 h,然后通風2h,并比較了氣態MeSA如何影響植株對蚜蟲的吸引力。在這樣的條件下,WT植株對蚜蟲的驅避性更強(擴展數據圖1t,u)。然而,在通風和不進行揮發性MeSA處理后,NAC2植株之間的蚜蟲驅避性沒有明顯差異(擴展數據圖1v,w)。此外,與未進行MeSA處理時觀察到的情況一樣,在MeSA處理下,與揮發性MeSA處理隨后通風的WT植株相比,NAC2植株對蚜蟲的吸引力仍然更大(擴展數據圖 1x,y)。
為了解釋這種現象背后的原因(擴展數據圖1t-y),研究人員用揮發性MeSA處理NAC2或WT植株24 h,然后通風,量化接收植株(接收器)排放的揮發性MeSA。WT植株反而在空氣中釋放出更高水平的MeSA(圖1a,b)。隨后研究人員比較了蚜蟲MeSA接收植株與模擬WT植株在涂抹后的吸引力,所有植株都含有MeSA/羊毛脂,但發現它們在蚜蟲偏好方面沒有差異(圖1c,d)。此外,在用MeSA/羊毛脂涂抹NAC2和WT接收植株后,這些MeSA接收植株還同樣吸引蚜蟲(圖1e,f)。接下來,研究人員以蚜蟲侵襲的植物為發射植株(發生源),研究了NAC2植株在自然露天環境下AD的作用(圖3a)。在被吸汁蚜蟲感染后,WT植株不斷排放VOC MeSA(圖1g,h)。值得注意的是,NAC2接收植株釋放的MeSA波動性較低,但是當發生源受到蚜蟲攻擊時,與WT接收植株相比,其表現出對蚜蟲更高的吸引力(圖1i-l)。與鄰近的模擬發射植株相比,受蚜蟲侵染的WT相鄰接收植株對蚜蟲的驅避性更強,而與模擬蚜蟲攻擊發射植株相鄰的NAC2接收植株之間的蚜蟲驅避性沒有顯著差異(圖1m,n)。此外,在以接收植株喂食24小時后,WT中的蚜蟲存活率降低,但NAC2接收植株的存活率沒有降低(圖 1o,p)。這些結果表明,一旦感知到MeSA,鄰近接收植株中的MeSA生物合成是以NAC2依賴性方式調節進而介導可對抗蚜蟲的AD。
擴展數據圖2
圖1
3. NAC2激活SAMT1轉錄
接下來,研究人員開始探索NAC2和MeSA生物合成之間的分子遺傳機制。NAC2作為轉錄因子(擴展數據圖3b),可以定位于細胞核中(擴展數據圖3c)。隨后,研究人員對有和沒有蚜蟲喂食的WT和NAC2植株進行了RNA測序(RNA-seq)和比較轉錄組分析,并鑒定了許多潛在的NAC2調節差異表達基因(擴展數據圖4和補充表1和2),其中SAMT1的結果特別令人感興趣(擴展數據圖4e)。無論這些植物是否受到蚜蟲的侵襲,NAC2植株的SAMT1 RNA水平都低于WT植株(補充表1和2)。SAMT1將SA轉化為MeSA19,研究人員通過定量研究NAC2、HA-NAC2過表達和WT植株葉片組織中的SAMT1轉錄本,以評估NAC2是否通過調節SAMT1的轉錄表達。結果表明,與WT植株相比,NAC2植株的SAMT1 mRNA水平顯著降低,但HA-NAC2過表達植株的SAMT1 mRNA水平升高(擴展數據圖3d,e)。此外,熒光素酶報告基因實驗表明,NAC2增強了SAMT1啟動子控制下的報告基因的轉錄(擴展數據圖3f)。ChIP–qPCR、酵母單雜交和EMSA分析均表明,NAC2與SAMT1啟動子結合,并激活報告基因轉錄(擴展數據圖3g-i)。此外,NAC2的瞬時過表達增加了植物MeSA的產生(擴展數據圖 3j)。這些結果表明,NAC2-SAMT1模塊與植物MeSA生物合成的調控有關。
擴展數據圖3
擴展數據圖4
4. SA激活NAC2-SAMT1模塊引發AD
為了研究NAC2是否通過激活SAMT1轉錄影響接收植株MeSA的產生,研究人員評估了不同處理條件下突變株NAC2、NahG和WT植株中的NAC2和SAMT1的mRNA水平(圖 2f)。蚜蟲侵襲后,WT和NAC2植株的SA水平升高程度相近,然而,細胞MeSA和SAMT表達的增加僅在WT植株中發現(圖2e-g)。在WT接收植株和NAC2接收植株鄰近蚜蟲侵襲植株中也發現了類似的結果(圖 2h-j)。這些結果表明,NAC2是蚜蟲定向誘導或蚜蟲介導的SAMT1表達和揮發性MeSA產生所必需的。此外,外源性SA上調了NAC2和SAMT1在WT植株中的表達,但在NAC2突變株中SAMT1 mRNA的表達水平未顯著改變(圖 2k,l)。與NAC2突變株相比,外源性SA也誘導WT植株的MeSA揮發性和蚜蟲驅避性(圖2m–p),并增加SAMT1-KO植株中NAC2和SAMT1轉錄本的水平(圖 2q;圖2b,c),samt1植株對蚜蟲的吸引力也更強,而且在samt1植株中外源性SA不誘導蚜蟲驅避(圖2r-t)。此外,暴露于蚜蟲侵襲的samt1植株中揮發性MeSA的產生減少(圖3a,b),在進一步的蚜蟲行為學實驗中,研究人員發現與鄰近模擬的WT接收植株相比,鄰近蚜蟲侵襲的WT發射植株的WT接收植株對蚜蟲的驅避性更強,然而,無論何時將這些發射植株暴露于蚜蟲侵襲中,與NAC2或SAMT1發射植株相鄰的WT接收植株在蚜蟲驅避性方面都沒有顯著差異(圖3c-e)。這些結果進一步證實了MeSA作為植物AD中PPC信號的作用??偟膩碚f,結果表明SA可以激活NAC2-SAMT1轉錄進而增加發射和接收植株中揮發性MeSA的產生。
作為一種SA結合蛋白,SABP2也可以與MeSA結合,這對于細胞內MeSA轉化為SA至關重要。因此,SABP2可以作為一種OBP樣受體,感知并將發射植株產生的揮發狀態MeSA轉化為SA以觸發NAC2介導的接收植株中的蚜蟲抗性。為了驗證這一想法,研究人員首先確認SABP2與SA結合(圖3f),通過競爭結合實驗驗證MeSA是否影響SABP2-SA的結合活性(圖3g)。在無MeSA的情況下,SABP2-[3H]SA(50 Ci mmol?1)結合力為100%。然而,在相同的實驗條件下,3nM和15nM的MeSA,SABP2對[3H]SA的結合活性分別降低到約74%和46%(圖3g)。因此,3nM的MeSA足以滿足用于[3H]SA與SABP2的競爭結合實驗,表明MeSA可以以生理濃度與SABP2結合。隨后,研究人員建立了SABP2-KO突變株(sabp2),并測試了sabp2突變株與WT植株的蚜蟲驅避性,用揮發性的MeSA處理,然后進行通氣,揮發性的MeSA處理可增加WT的蚜蟲驅避性和SA生物合成,但對于sabp2突變株并沒有增加(圖3h-j和擴展圖2d)。此外,蚜蟲喂食WT發射植株增加了WT植株的蚜蟲驅避性,但sabp2未增加(圖3k)。此外,外源性的SA對WT和sabp2植株的MeSA揮發性無顯著差異,表明SABP2對MeSA的釋放不是必須的(圖3l,m)。這些結果表明,SABP2確實是一種OBP樣受體,可以感知并將空氣中的MeSA轉化為SA,引起NAC2介導的蚜蟲驅避性。
SAMT1是植物抗病毒免疫所必需的。為了測試SAMT1是否為NAC2介導的植物抗病毒免疫中的一個組成部分。研究人員敲低(KD)samt1植株中的NAC2,使用基于煙草脆裂病毒(TRV)誘導的基因沉默產生nac2/samt1雙突變植株。與NAC2突變株一樣,NAC2-KD植株表現出正常生長,和對CMV和PVY的高易感性(圖1e-j,擴展數據圖5a-e,h-l),表明病毒誘導的基因沉默NAC2-KD與NAC2-KO株有相似性。然而,nac2/samt1和samt1植株表現出相似程度的CMV或PVY易感性(圖 5a-e,h-l)。此外,CMV感染增強了植物細胞內MeSA水平(擴展數據圖5f)。在病毒感染期間,NAC2-KD、samt1和nac2/samt1植株的未侵襲葉片產生相似數量的MeSA,但與WT植株相比,數量較低(擴展數據圖5g)。此外,作者還研究了外源性MeSA或SA在nac2、sabp2、samt1和WT不同植株中,MeSA是否以及如何通過NAC2介導植物抗病毒防御。與WT植株相比,nac2、samt1和sabp2植株對CMV和PVY更易感(圖3n,o)。然而,外源性MeSA可以降低nac2和samt1植株的病毒易感性,但對sabp2植株無效(圖 3n,o),可能是由于WT、nac2和samt1植株中的MeSA轉化為 SA。外噴SA也可以降低nac2、samt1和sabp2植株的病毒易感性(圖3n,o)。這與以下事實一致:SA可以抑制多種病毒對植物的感染,包括CMV、馬鈴薯病毒X和TMV。
綜上所述,MeSA結合蛋白SABP2能夠在結合MeSA時,將細胞間的MeSA轉化成SA。由此實現信號的發起。隨后SA激活NAC2-SAMT1模塊,以此上調內源MeSA水平,促進NAC2依賴性SAMT1的轉錄與翻譯。
擴展數據圖5
5. CMV1a破壞NAC2的穩定性以抑制AD
研究表明CMV感染可以抑制蚜蟲誘導的AD(圖4a),從而有利于蚜蟲的生存和病毒的傳播與感染,可能是通過CMV介導MeSA所致。CMV1a-NAC2相互作用(擴展數據圖1a-d)表明CMV1a可能參與CMV介導的AD抑制。為了驗證這一點,首先生成了表達CMV1a的轉基因煙草植物(擴展數據圖6a,b),并評估了CMV1a對植物、蚜蟲和AD吸引力的影響。圓形培養皿和Y管嗅覺儀生物測定表明,CMV1a表達導致植物對蚜蟲具有更高的吸引力(擴展數據圖 6c,d)。表明CMV1a參與CMV介導的AD抑制。
為了了解 CMV1a-NAC2相互作用在CMV介導的AD抑制中的重要性,研究人員鑒定了CMV1a中與NAC2相互作用的關鍵氨基酸。CMV1a由N端甲基轉移酶和C端ATP依賴性解旋酶結構域(HD)組成。此外,研究人員發現CMV1a HD是CMV1a-NAC2相互作用的主要區域(擴展數據圖6l)。隨后,研究人員使用Alpha Fold-Multimer27模擬了CMV1a-NAC2復合物的結構,并觀察到 CMV1a中983位的甘氨酸殘基與NAC2物理距離最近,預測該殘基可能是CMV1a與NAC2相互作用所必需的(擴展數據圖6m,n)。CMV1a HD或全長CMV1a中的G983D突變嚴重降低了CMV1a-NAC2的相互作用(擴展數據圖 6o-q)。
接下來,研究人員使用BiFC研究了CMV1a-NAC2相互作用的亞細胞定位,發現CMV1a在細胞核和細胞質中都與NAC2相互作用(圖1c),這與沒有CMV1a共表達的NAC2定位不同(圖3c),表明CMV1a可以將一些NAC2從細胞核轉移到細胞質。類似的還有CMV1a–MYC,但是cLUC–MYC和CMV1a(G983D)-MYC均未出現這種現象,這或許可以解釋引起部分RFP-NAC2的細胞質定位和細胞核中較少的RFP熒光(擴展數據圖 7a)。值得注意的是,CMV1a-MYC沒有改變RFP核定位,表明CMV1a-MYC定向NAC2的重新定位取決于NAC2-CMV1a相互作用(擴展數據圖7b)。此外,研究人員使用核輸出信號(NES)標記的NAC2研究了細胞質NAC2的穩定性。結果發現NES-NAC2定位于細胞質中,NAC2易被26S-蛋白酶體系統降解(擴展數據圖7c,d)。此外,瞬時CMV1a表達增強了26S-蛋白酶體系統對NAC2的降解,但不影響RFP穩定性(擴展數據圖 7e-i),而CMV1a(G983D)未引起NAC2降解(擴展數據圖7f–i)。
瞬時表達試驗表明,是CMV1a而非CMV1a(G983D)抑制NAC2介導的SAMT1激活啟動子(擴展數據圖7j)。此外,CMV1a(G983D)或CMV1a植株與WT植株的Y管嗅覺儀生物測定和GC-MS分析表明,CMV1a(G983D)降低CMV1a介導的植物對蚜蟲的吸引力和抑制MeSA揮發(擴展數據圖7k-m)。而且Y管嗅覺儀生物測定提供了額外的證據,證實氨基酸殘基Gly983對CMV1a抑制植株間AD至關重要。
綜上所述,表明CMV1a通過與NAC2的直接相互作用,影響NAC2的亞細胞定位并破壞其穩定性,從而降低轉錄因子NAC2驅動的SAMT1激活和MeSA的產生,進而干擾和抑制AD。
圖4
6. 一些蚜蟲傳播的病毒抑制AD
CMV1a具有甲基轉移酶和解旋酶活性,并構成病毒復制酶復合物的一部分,通過其HD與NAC2相互作用(擴展數據圖1a-d)。值得注意的是,來自許多蚜蟲傳播病毒的HDs,包括馬鈴薯Y病毒、黃蜂病毒、黃體病毒和阿爾法莫病毒在與CMV1a Gly983相對應的位置均含有保守的甘氨酸殘基(擴展數據圖8和9a)。
GC-MS分析顯示,PVY感染并影響了蚜蟲侵染后植物MeSA的揮發。此外,作者還研究了,兩種蚜蟲傳播的病毒CMV和PVY使NAC2能夠從細胞核到細胞質重新定位(擴展數據圖9i)。同樣,PVY CI,而不是CI(G347D)或非蚜蟲傳播病毒TMV的126KD蛋白,與NAC2相互作用(擴展數據圖9j,k),并部分破壞NAC2的穩定性(擴展數據圖9l)。這些結果表明,一些蚜蟲傳播的病毒已經進化到利用含HD的蛋白質作為干擾植物AD的一般策略。
擴展數據圖8
擴展數據圖9
結論
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