文獻(xiàn)背景
中性粒細(xì)胞作為體內(nèi)必需的先天免疫細(xì)胞,在癌癥監(jiān)測中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(ELANE)可以準(zhǔn)確識別并快速消除突變的腫瘤細(xì)胞。ELANE及其同源的豬胰腺彈性蛋白酶(PPE)不僅具有與ELANE相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和初級底物特異性,而且具有切割C末端CD95結(jié)構(gòu)域的能力。釋放的CD95蛋白的死亡結(jié)構(gòu)域與癌細(xì)胞中高表達(dá)的組蛋白H1相互作用,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。PPE和ELANE對抑制劑的敏感性不同,PPE對絲氨酸蛋白酶抑制的敏感性較低。此外,PPE不僅比ELANE更容易獲得,而且對皮下腫瘤的治療效果更顯著,副作用更低。
由于PPE在體內(nèi)的活性有限,將其轉(zhuǎn)化為有效的抗腫瘤藥物仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。首先,PPE在細(xì)胞水平上切割CD95蛋白的效率很低,導(dǎo)致藥理作用不足。其次,體內(nèi)給藥后,PPE活性容易被高濃度的絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制,包括血漿α2-巨球蛋白和α1-抗胰蛋白酶,但其在體內(nèi)腫瘤組織中的定位還不夠精確。許多蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能可以通過一些特殊金屬離子等輔助因子進(jìn)行精確調(diào)控。這些輔助因子可以通過底物結(jié)合和酶催化來激活或抑制蛋白質(zhì)的活性。例如,鐵離子可以促進(jìn)血紅素蛋白對氧的轉(zhuǎn)移和運輸。作者提出了一種基于金屬輔因子的策略,可用于保護(hù)和增強切割目標(biāo)蛋白質(zhì)時彈性蛋白酶的活性,并開發(fā)了一種裂解活性增強的彈性蛋白酶納米復(fù)合物(CAEN),以Mn2+作為輔助因子,形成Ca2+的生物礦化外殼。以PPE為模型藥物,少量Mn2+與其活性中心結(jié)合,提高了切割效率,保護(hù)PPE免受絲氨酸蛋白酶的抑制。生物礦化外殼保護(hù)了PPE的活性不被激活,增強了對腫瘤細(xì)胞的藥物輸送。通過非侵入性霧化吸入給藥方式治療肺癌,實現(xiàn)器官特異性給藥。癌細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境促進(jìn)了納米外殼的溶解,進(jìn)一步釋放了含有鈣和錳的PPE蛋白。在細(xì)胞水平上,與游離PPE相比,含Mn2+的PPE對CD95蛋白具有更高的切割效率和更強的誘導(dǎo)凋亡作用。在體內(nèi),CAEN可以有效地遞送到腫瘤細(xì)胞中,且該系統(tǒng)中的金屬離子能夠有效激活肺癌組織的局部免疫系統(tǒng),產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。
基本信息
題目:An elastase nanocomplex with metal cofactors for enhancement of target
protein cleavage activity and synergistic antitumor effect
期刊:Chemical Engineering Journal
影響因子:15.1
DOI:10.1016/j.cej.2024.149902
通訊作者:林志強 梁令 李天成
作者單位:
北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院
首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院
索萊寶相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
K009725P | Anti-Mki67 Polyclonal Antibody |
K002374P | Anti-CD8A Polyclonal Antibody |
K200057M | Anti-GAPDH Monoclonal Antibody |
摘要
ELANE通過裂解靶蛋白,在識別和破壞各種癌細(xì)胞方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而,由于其蛋白質(zhì)裂解效率不足、缺乏腫瘤組織靶向性以及對絲氨酸蛋白酶抑制的敏感性使ELANE的體內(nèi)治療效果受到限制。本研究采用基于金屬輔因子的方法增強靶蛋白裂解和抗腫瘤作用,使用PPE為模型藥物,在體外開發(fā)并優(yōu)化了一種具有增強切割活性的CAEN。通過吸入給藥,CAEN防止了PPE在生物環(huán)境中的降解,并有效地將其輸送到腫瘤細(xì)胞。與游離的PPE相比,CAEN能以更高的特異性有效裂解CD95,從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞顯著凋亡。此外,釋放的金屬離子可以激活巨噬細(xì)胞中的I型干擾素,進(jìn)一步增強肺癌組織內(nèi)的局部免疫反應(yīng)。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.CAEN可以保護(hù)和穩(wěn)定PPE蛋白的活性
通過生物礦化過程制備了切割活性增強型CAEN(圖1)。圖2A顯示了孵育時間和金屬離子含量對CAEN形成的影響。透射電子顯微鏡結(jié)果(圖2B)顯示納米顆粒通常是均勻的、球形的,PPE和CAEN的平均尺寸分別為10.26±0.87 nm和148.79±6.00 nm(圖2C)。如圖2D,PPE和CAEN的電位結(jié)果分別為負(fù)電位和正電位。蛋白質(zhì)表面富含羧基,PPE在中性溶液中表面帶負(fù)電荷,電位的變化指示了生物礦化外殼的有效形成。能量色散X-射線光譜分析結(jié)果證實CAEN由Ca、Mn、P、C、O和N組成(圖2E)。圖2G中的紅外光譜結(jié)果顯示了納米顆粒的組成。納米顆粒含有Ca、Mn、P、N和O,Mn2+離子的價態(tài)主要為二價(圖2F)。如圖2H-K,納米顆粒對PPE蛋白的活性具有保護(hù)作用。
圖1
2.CAEN可以特異性切割CD95促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡
在由H57、D102、S195和S214組成的PPE的活性中心周圍,Mn2+而不是Ca2+與D60和D97相互作用(圖3A,B)。此外,Mn2+與PPE蛋白能夠相互結(jié)合。將Mn2+和PPE的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)與PPE和小分子抑制劑的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較(圖3C),Mn2+改變了PPE蛋白的結(jié)構(gòu),與蛋白質(zhì)印跡實驗中白蛋白對非特異性條帶的阻斷作用相似。為了驗證不同制備組對CD95的切割能力,純化MBP-CD95蛋白并對其進(jìn)行切割實驗(圖3E-G)。MBP-CD95(200-335)的理論分子量為58.3kD(圖3D)。將不同的制劑組與MBP-CD95蛋白孵育30min(圖3E)。CAEN組和PPE蛋白組均能有效地切割MBP-CD95,但PPE組切割MBP-CD95,而CAEN組僅選擇性切割CD95蛋白。為了測試CAEN在腫瘤細(xì)胞內(nèi)切割CD95的能力,進(jìn)行了不同劑型(PBS、PPE、NP或CAEN)處理MDA-MB-231細(xì)胞和A549細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡實驗。CAEN治療組較其他對照組有較深的條帶,證實了CAEN有效切割CD95蛋白的能力(圖S14)。CAEN治療組腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例最為顯著(圖3F,G),表明CAEN具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。與PBS和PPE組相比,CAEN組與腫瘤細(xì)胞孵育6h后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平顯著升高,CAEN組大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低,細(xì)胞內(nèi)線粒體功能受損(圖3H)。在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步測定了不同處理組B16-F10細(xì)胞的凋亡指數(shù)(圖3I)。
圖2
3.CAEN可提高輸送效率和肺滯留時間
將B16-F10與CAEN-FITC共孵育4h后,綠色熒光彌散在腫瘤細(xì)胞的胞漿中,表明CAEN能有效和快速地被腫瘤細(xì)胞吸收(圖4A)。為驗證氣霧劑的成功給藥,使用考馬斯亮藍(lán)溶液(CBB)作為指示劑證明藥物可以有效地進(jìn)入小鼠的肺組織。小鼠肺組織中有大量CBB溶液,主要分布在氣管和支氣管(圖4B)。使用肺霧化噴霧給小鼠注射該藥物來研究CAEN的保留情況(圖4C)。使用Cy7熒光染料標(biāo)記的PPE進(jìn)行肺噴霧給藥,熒光成像結(jié)果顯示CAEN-Cy7處理的肺組織中熒光分布更強、更深,表明礦化納米顆粒作為載體具有良好的穿透和保留能力(圖4D、E)。
圖3
圖S14
圖4
4. CAEN體內(nèi)釋放對腫瘤生長的抑制作用
為驗證CAEN的抗腫瘤作用,將B16-F10細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入C57BL/6小鼠,形成局部抗腫瘤治療的肺癌模型(圖5A)。分別于第5、13、21天解剖小鼠,收集肺組織。隨后,計數(shù)小鼠肺組織中的轉(zhuǎn)移灶。如圖5B、C所示,CAEN組在抗腫瘤治療期間保持了良好的療效,沒有明顯的轉(zhuǎn)移。在治療期間,小鼠的體重沒有顯著變化(圖5D)。心、肝、脾、肺和腎等主要器官的染色結(jié)果表明,CAEN并未引起這些器官明顯的病理變化(圖5E)。腫瘤組織HE染色顯示,CAEN組小鼠組織切片中癌細(xì)胞較少,而PBS組和PPE組腫瘤細(xì)胞數(shù)量較多(圖5F)。對健康小鼠進(jìn)行相同處理后,發(fā)現(xiàn)PPE治療組對健康小鼠肺組織造成炎性損傷,CAEN治療組和PBS治療組無明顯變化(圖5G)。如圖5H-K所示,TUNEL染色證實CAEN有效地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡,且CAEN組CD8+T細(xì)胞比例在所有治療組中最高。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,CAEN能顯著減少腫瘤組織中Ki67+細(xì)胞的數(shù)量,有效抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖(圖S19)。
5. CAEN具有良好的生物安全性
CAEN對心、肝、腎功能無明顯影響(圖6A-C)。相比之下,PPE組各項指標(biāo)均升高,且有一定毒性。血液學(xué)分析顯示,包括PBS、PPE或CAEN在內(nèi)的不同治療組小鼠的紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)水平保持在正常范圍內(nèi)(見圖6D-F)。
圖5
圖S19
結(jié)論
PPE作為一種新型的抗腫瘤蛋白藥物,具有很強的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。本研究設(shè)計并制備了一種含有Ca2+、PPE及其輔因子(Mn2+)的切割活性增強型彈性酶納米復(fù)合體(CAEN),來實現(xiàn)對CD95蛋白的特異性切割。CAEN不僅能有效保護(hù)和穩(wěn)定PPE蛋白的活性,而且對不同類型的癌細(xì)胞具有有效的殺傷作用。此外,基于鈣離子的生物礦化策略可以有效地提高細(xì)胞內(nèi)攝取,對控制和預(yù)防PPE引起的肺組織蛋白酶相關(guān)的平衡失調(diào)起到積極的作用。CAEN中金屬離子的釋放影響了腫瘤細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高和線粒體損傷。結(jié)合Mn2+的免疫激活功能,具有良好生物安全性的CAEN在體內(nèi)外均能有效抑制癌細(xì)胞的生長。總之,本研究為蛋白質(zhì)藥物在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供了一種有效的研究思路。
索萊寶產(chǎn)品亮點
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