選擇合適的重組蛋白產品,對你得到正確的實驗結果關重要,可從以下幾點進行選擇:
1、蛋白來源
對于一些蛋白,需要進行一系列的翻譯后修飾才能成為具有活性的成熟蛋白。細菌不能提供這樣的修飾,而哺乳動物細胞可以。因此,選購時應注意蛋白的來源。例如,novaprotein的人IL-4是在E. coli中制備的,金斯瑞的人IL-4是在哺乳動物CHO細胞中制備的。
當然除了上面提到的兩種表達系統外,還有酵母和昆蟲表達系統,四種系統各有優劣,選重組蛋白是一定要注意。
表達 | 細胞 | 優點 | 缺點 |
原核 | E.coli | 繁殖快、成本低、產量高;遺傳背景及基因表達調控機制清楚;易于大規模培養,成本低廉 | 蛋白常為包涵體,純化困難;無糖基化(分泌蛋白,細胞膜上蛋白不可用),生物活性不定;無翻譯后修飾,內毒素含量高 |
酵母 | Pichia | 使用簡單,表達量高,His-tag便于純化,一定的翻譯后加工可進行糖基化修飾,操作簡單,適合大規模生產;可誘導表達,也可分泌表達,產物便于純化 | 有時會出現蛋白切割問題;糖基化不能滿足要求 |
昆蟲 | High-5 | 產量高,翻譯后加工與哺乳動物相似;對于部分有毒性或較難表達蛋白有優勢;無內毒素污染 | 蛋白活性不如哺乳動物;適合表達激酶等定位于細胞內的真核蛋白 |
哺乳 | CHO; HEK293 | 完善的翻譯后加工,活性接近天然蛋白 | 周期長、技術要求高;表達產量低 |
2、種屬來源
蛋白的種屬來源常見的有人源、小鼠源和大鼠源等。一般來說,不同種屬之間的蛋白同源性在80%以上就可視為有交叉活性,可推薦使用。
3、生物活性和穩定性
蛋白的純度、內毒素水平和批次間穩定性等直接會影響實驗結果,因此,高品質的蛋白產品會嚴格監控這一環節,并且提供詳細數據。同時,在選擇蛋白產品時還需考慮其生物活性。
一般記得以下五點就行:
· 大多數人類細胞因子對小鼠細胞都有活性。
· 許多小鼠細胞因子對人類細胞也有活性,但比相應人類細胞因子活性低。
· 一些人類的細胞因子(如IL-7)在小鼠細胞中表現出比小鼠細胞因子更高的活性。
· 干擾素、GM-CSF、IL-3 和IL-4 有物種特異性,對于非人類細胞幾乎沒有活性。
· 成纖維細胞生長因子和神經營養因子是高度保守的,在其它的動物細胞中也能表現很好的活性。
4、蛋白形式
通常有兩種形式:含牛血清白蛋白BSA或不含BSA,不含BSA一般用“CF"表示。加入BSA可以提高蛋白質的穩定性,增加了貯存期限。含BSA的蛋白可以作為細胞組織培養物或者ELISA實驗中的理想標準品,而CF形式的蛋白尤其適用于活體實驗。以R&D systems的Human IL?4為例,就有兩種形式,買之前要先明確自己用來做什么實驗的。
5、查閱文獻
這個是快捷的方法,怎么去查文獻是我們必須要掌握的技能。
雖有萬般方法,但是只要你會查閱文獻,則萬事皆定。
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