各種動物外周血淋巴細胞分離液說明書
200ml
室溫避光儲存，有效期少2 年。
本分離液為Ficoll、羥yi基淀粉550與泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝外周血可在分離液中分層。離心時，
在Ficoll、羥yi基淀粉的作用下紅細胞與粒細胞聚集并迅速沉降；此時，淋巴細胞及其他單個核細胞仍處于
分離液上層，紅細胞污染可忽略不計。大部分血小板可在細胞清洗低速離心過程中去除。 其他人及動物多
種比重細胞分離液，因不同種屬不同比重分離液的細胞離散系數(shù)及細胞帶電不同，用戶在制定分離液時應(yīng)
提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細胞的名稱。
適用于從動物抗凝血液中分離淋巴細胞，無菌條件下所分離的淋巴細胞可用于細胞培養(yǎng)等。本品僅供
科研使用。
A．本實驗要求，在正常大氣壓下，分離液、分離樣本以及分離環(huán)境溫度為20℃±2℃。分離液在低溫時呈較
高密度，在高溫時呈較低密度。細胞分離液從冰箱取出后，不可立即使用，操作前可將樣本和分離液復溫
18-22℃。為獲得佳的實驗結(jié)果，好在取血后2小時內(nèi)進行實驗，血液提取后存放時間越長細胞活性
越低。
B．實驗過程中，如需稀釋血液或洗滌細胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會導致血
細胞凝集，大大降低細胞得率及純度。
C．優(yōu)抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素，其他抗凝劑也可使用，但會影響細胞活性。應(yīng)注意在血液稀
釋過程中去除抗凝劑體積。
D．實驗操作時，不可使用含粉手套、不可使用內(nèi)毒素含量過高的液體，手套中的粉末顆粒及高內(nèi)毒素會激
活淋巴細胞從而降低細胞得率及活性。
E．本實驗不可使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，其帶有的靜電作用將導致細胞貼壁影響分離效
果。推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。
F．吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。
吸取過多的淋巴細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。
G．如需進行B、T細胞計數(shù)，則需血液貯藏時間不得多于10小時，否則將導致細胞被激活，得率降低。
H．為去除所混雜的血小板，可在分離液上層加上4-20%蔗糖梯度等滲溶液進行二次離心。
I．細胞純度可在步驟10后使用瑞氏染色方法確定，細胞活性可用臺盼藍處理后觀察。
J．由于各品牌離心機的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調(diào)
節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時間，摸索佳的分離條件（具體分離條件各實驗室自定）。
一、當血液樣本小于3ml時，實驗方法如下：
1. 取一支15ml離心管，加入3ml分離液置于18-22℃復溫。
2. 將血液樣本小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g離心20分鐘。低溫（如4℃）離心會降低細胞
得率。
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3. 離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含淋巴細胞的細胞層）0.5cm以上的上清液部分，棄去。
4. 用吸管小心吸取分離液層及淋巴細胞層于另一新離心管內(nèi)。
5. 在步驟4中所得離心管中加入10ml PBS緩沖液或HBSS緩沖液混勻。
6. 250g離心10分鐘。
7. 棄上清。
8. 用吸管以5ml PBS緩沖液或HBSS緩沖液重懸所得細胞。
9. 250g離心10分鐘。
10. 棄上清。重復步驟7、8、9，后以0.5ml后續(xù)試驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。
二、當血液樣本大于3ml時，實驗方法如下：
1. 當血液樣本粘度過高或血液樣本大于等于3ml時，優(yōu)稀釋方法：將血液于18-22℃以250g離心10分
鐘，棄去血漿，補充添加生理鹽水，添加量為所棄去血漿體積的1.5-2倍，混勻備用。注：不當?shù)南♂尫椒?br>會降低細胞得率及活性。
2. 取一支適當?shù)碾x心管，加入分離液（加入量與稀釋后的血液樣本體積相等），置于18-22℃復溫。
3. 將經(jīng)稀釋處理的血液樣本小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g離心20分鐘。低溫（如4℃）離
心會降低細胞得率。注：加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二。
4. 剩余步驟同“情況一"中步驟3步驟10。
pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素 ≤0.5EU/ml
無菌 直接接種培養(yǎng)14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每50ml 溶液中含10μm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25μm 以上的不溶性微粒5 粒以下
本分離液是敏光型的，應(yīng)在18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置4℃保存，溶液變渾濁或污染
細菌時，產(chǎn)品失效。保存溫度較低（10℃以下）時分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
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