一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC)說明書
貨號：CA1040
規格：25T/50T
保存：-20℃保存，FITC-dUTP需避光保存。如果頻繁使用（一周內），5×Reaction Buffer，FITC-dUTP和抗熒光淬滅封片劑可2-8℃保存。
產品簡介：
一步法TUNEL細胞凋亡檢測是一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于經過固定和洗滌的細胞或組織，只要經過一步染色反應，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測到凋亡細胞。細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以觀察到180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上熒光素(FITC)標記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL(TdT--mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理。
本試劑盒有如下優點。
(1)高靈敏度：可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡，同時由于凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測到早期的細胞凋亡。
(2)特異性：TUNEL檢測時通常更容易標記凋亡細胞，而不容易標記壞死細胞。
(3)快速：僅需約1-2個小時即可完成。
(4)方便：只需一步染色反應，洗滌后即可觀察，不必使用二抗等進行多步操作。
(5)應用范圍廣：可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。 TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產生的DNA斷裂，但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂(和細胞凋亡時的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區分開，另一方面也不會把射線等誘導發生DNA斷裂的非凋亡細胞判斷為凋亡細胞。 極少數細胞凋亡時沒有DNA斷裂，此時不適用TUNEL法檢測。在個別類型的壞死細胞中也發現TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下，好同時檢測多個凋亡指標。
產品內容：
試劑名稱 包裝 包裝
TdT酶 25μl 50μl
FITC-dUTP 25μl 50μl
5×Reaction Buffer 400μl 2×400μl
抗熒光淬滅封片劑 2.5ml 5ml
說明書 1份 1份
注意事項：
用戶需自備用于洗滌細胞的PBS或HBSS，用于固定的4%多聚甲醛，同時需自備含0.1% Triton X-100的PBS。如果用于石蠟切片的檢測，需自備蛋白酶K，二甲苯。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 操作步驟：
1. 對于貼壁細胞或細胞涂片：
a. PBS或HBSS洗滌一次。
b.如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。
c.用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。
d.用PBS或HBSS洗滌一次。
e.加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
f.轉步驟5。
2. 對于懸浮細胞或細胞懸液：
a. 收集細胞(不超過2×106細胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動的同時進行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細胞，冰浴孵育2分鐘。
e. 轉步驟5。
3. 對于石蠟切片：
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。
b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的佳作用溫度和時間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。
d. 轉步驟5。
4. 對于冷凍切片：
a. 用4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
d. 轉步驟5。 5. 配制TUNEL檢測液： 參考下表配制適當量的TUNEL檢測液，需充分混勻。注意：配制好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。陰性對照不加TdT酶，其余相同。
1個樣品 5個樣品 10個樣品
TdT酶 1μl 5μl 10μl
FITC-dUTP 1μl 5μl 10μl
5×Reaction Buffer 10μl 50μl 100μl
ddH2O 38μl 190μl 380μl
總體積 50μl 250μl 500μl
6. 對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤，以盡量減少TUNEL檢測液的蒸發。或者置濕盒中。
c. PBS或HBSS洗滌3次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長范圍為450-500nm，發射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。
7. 對于懸浮細胞或細胞懸液：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育30-60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長范圍為450-500nm，發射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。
常見問題：
1. 出現非特異性熒光標記。
a. 有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現非特異性的熒光標記。解決方法是，取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。
b. 使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液，導致出現假陽性。建議采用推薦的固定液。
c. TUNEL檢測反應時間過長，或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性熒光。注意控制反應時間，并確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。
2. 熒光背景很高。
a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。 b. 高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。
c. TUNEL反應過強。可以用雙蒸水稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當時使用。
d. 紅細胞中血紅蛋白導致的自發熒光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。
3. 標記效率低。
a. 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。
b. 固定時間過長，導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。
c. 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅，解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發產生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5微克/毫升碘化丙啶。
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