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PCR常見問題分析與對策

PCR常見問題分析與對策

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1.PCR產物的電泳檢測時間
  一般為48h以內,有些好于當日電泳檢測,大于48h后帶型不規則甚致消失。 

2.假陰性,不出現擴增條帶
  PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量及, ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
  模板:①模板中含有雜蛋白質,②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質沒有消 化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。⑤模 板核酸變性不*。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應 固定不宜隨意更改。
  酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
  引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度 高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有 引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條 帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條 亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。④引物設計不合理,如引物長度不 夠,引物之間形成二聚體等。
  Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特 異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
  反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul,應用多 大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul 后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。
  物理原因:變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出 現假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
  靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。

3.假陽性
  出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。
  引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增 時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽 性。需重新設計引物。
  靶序列或擴增產物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交 叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:①操作時應小心輕柔,防止 將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時,在加標本 前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污 染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后,可擴 增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

4.出現非特異性擴增帶
  PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:一是引物與靶序列不*互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有:①必要時重新設計引 物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量,適當增加模板量,減少循環次 數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

5.出現片狀拖帶或涂抹帶
  PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。其對策有:①減少酶量,或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量,減少循環次數。

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